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EGS是不溶于水的同功能的N-羟基琥珀酰亚胺酯（NHS-酯）。间隔臂包含两个羟胺破碎裂解的酯位点，能产生两个具有末端酰胺键的片段并释放乙二醇。这些试剂通常用于将放射性标记的配体与细胞表面受体结合。水不溶性的EGS试剂没有带电基团，是亲脂性的，因此是膜可渗透的，可用于细胞内和膜内蛋白质的共轭反应。需要先将EGS溶于DMSO或DMF中，并以10～20%的终浓度加入到水相反应混合物中，以尽量减少对蛋白质的不利影响。

pH7～9，蛋白质和肽N-末端的α-胺基和赖氨酸的α-胺基能够与NHS酯反应形成共价酰胺键，释放N-羟基琥珀酰亚胺。但是NHS酯的水解是一个竞争反应，速度随pH的增加而加快。在稀释的蛋白质溶液中更易发生水解，浓缩的蛋白质溶液更有利于酰化反应。

NHS酯交联反应通常在磷酸盐，碳酸盐/碳酸氢盐，HEPES和硼酸盐缓冲液中进行。也可以使用其它无胺缓冲液，如Tris或甘氨酸。在中性至碱性pH下，使用过量的Tris或甘氨酸可以淬灭该反应。

• 样品制备：
  
  • 交联剂溶液：使用前将EGS溶于无水DMSO中（10～25mM）。
    
  • 反应缓冲液：磷酸盐缓冲液或其它pH7～9的无胺缓冲液，如HEPES，碳酸氢盐/碳酸盐或硼酸盐缓冲液
    
  • 淬灭溶液：1M Tris，pH7.5或其他含胺缓冲液。可自主选择是否淬灭，某些应用可能不需要。
  
  
• 在溶液中交联蛋白的方法
  
  • 在反应缓冲液中制备蛋白质样品。
    
  • 向蛋白质样品中加入所需的交联剂。如果蛋白质浓度大于5mg/ml，则使用10倍摩尔过量的交联剂。若样品小于5mg/ml，使用20～50倍摩尔过量的交联剂。建议使用的交联剂终浓度为0.25～5mM。
    注意：为了尽量减少对蛋白质的有害影响，在最终反应体积中DMSO不得超过10～20%。
    
  • 将反应混合物在室温下孵育30分钟或在冰上孵育2小时。
    
  • 加入20～50mM的胺溶液（如Tris或甘氨酸）淬灭反应，时间为15分钟。
    
  • 将反应混合物再孵育15分钟。
  
  
• 细胞内和细胞外蛋白交联的实例程序
  
  • 将0.1～0.5mg膜和5～10 nM配体在总体积为100μL的PBS中，4℃下孵育1小时。
    
  • 加入EGS溶液至终浓度为1～2mM。
    
  • 将反应混合物在室温下孵育30分钟或在冰上孵育2小时。
    
  • 加入淬灭溶液至终浓度为10～20mM，孵育15分钟。
    注：因为Sulfo-EGS(货号：GS4355)不会渗透细胞膜，可以用来交联细胞表面蛋白。在细胞内交联蛋白质时使用EGS。但请注意，一些EGS会在胺基通过细胞膜时与胺反应。
  
  
• 用羟胺·HCl切割EGS交联的化合物的方法
  
  • 所需材料：羟胺·HHCl，磷酸盐缓冲液（PBS），pH8.5。
    
  • 用PBS制备2.0M羟胺·HCl并将pH调回8.5，在实验前准备。
    
  • 将羟胺·HCl溶液快速加热至37℃，加入等体积的样品，不断搅拌，孵育3～6小时。或在室温下孵育6小时，但效率可能较低。
    
  • 通过SDS-PAGE可以确定切割的有效性。每等分试羟胺裂解样品含有13～14μg蛋白质的。

• EGS对湿度敏感，在4～8℃干燥保存。为了避免产品中的水分冷凝，开瓶前必须平衡到室温。
  
• NHS-酯易水解并无活性，因此不要制备用于储存的储备溶液，实验前配制，弃掉所有重构交联剂。DMSO或DMF是能吸收水分，促进其水解。
  
• 避免使用含有胺（如Tris和甘氨酸）的缓冲液，因为胺对反应有竞争性，会抑制和降低共轭效率。
  
• 每个反应使用的交联剂的量取决于蛋白质的量和浓度。当交联稀释的蛋白质溶液（例如2mg/ml）时，与浓缩的蛋白质溶液（例如10mg/ml）相比，要使用更大摩尔过量的交联剂才能达到相同的交联效果。例如，对于10mg/ml蛋白质溶液，使用20～50倍摩尔过量的试剂，但对于2mg/ml蛋白质溶液，只需10倍摩尔过量的交联剂。调节交联剂与蛋白质的摩尔比可以控制共轭和聚合的程度。
  
• 加入到水相中时，这些试剂会以高浓度形成微沉淀物，导致溶液浑浊。但反应可以有效地进行，微沉淀物会在交联过程中消失。可以优化步骤以确保NHS酯的完全溶解。例如，水相中可以补充有机溶剂。